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丁香假单胞菌番茄变种DC3000HrpA蛋白单链抗体的制备与分析

作　者: 张新艳
导　师: 王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: HrpA蛋白 hrP基因 单链抗体 工程抗体 噬菌体展示
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


Hrp（hypersensitive response and pathogenicity，Hrp）基因广泛存在于植物病原细菌中，参与Hrp极毛系统的组装，不仅可运输效应蛋白至植物细胞，导致HR或抗病性，还可运输致病性和毒性蛋白或抑制子活性物质，引起植物病害。hrp基因多串联成簇且相当保守，在诱导培养基或植物体内，基因簇中的hrpA基因编码细菌表面附属物Hrp极毛的结构蛋白HrpA。Hrp极毛在植物-病原细菌互作中扮演十分重要的角色。病原细菌能否使亲和性植物发病与其是否有Hrp极毛有直接的关系。 在对hrp基因进行深入研究的基础上，我们尝试设计新的化学药剂和抗体阻止Hrp Ⅲ型分泌系统的组装或致病毒力蛋白因子的分泌运输，从而有效限制植物细菌病害的发展。本研究从特异性的以转化了丁香假单胞菌番茄变种菌株DC3000（Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000）hrpA基因的大肠杆菌（SGpQEHrpA／Ps）BL21（DE3）表达的工程蛋白HrpA／Ps为抗原制备而得的单克隆杂交瘤细胞系中提取RNA，经过RT-PCR获得抗体可变区基因，利用一柔性肽段（Linker）连接形成单链抗体（single chain variable fragment，scFv），后应用基因工程方法，将scFv与噬菌粒载体pCANTAB-5E连接，转化大肠杆菌TG1，获得单链抗体噬菌体文库。此后，利用噬菌体展示技术对抗体库进行了5轮淘选（panning），获得了HrpA特异性的单链抗体。 以单克隆抗体为来源的单链抗体，亲和力和特异性都较好，可以为进一步进行植物抗病基因工程和植物抗体研究提供基因来源。

全文目录


摘要  7-8
英文摘要  8-9
1 前言  9-10
2 文献综述  10-21
  2.1 植物病原细菌hrp基因  10-15
  2.2 抗体工程  15-21
3 材料与方法  21-33
  3.1 材料  21-24
    3.1.1 细胞及细胞株  21-22
    3.1.2 质粒载体  22
    3.1.3 PCR引物  22-23
    3.1.4 试剂与材料  23
    3.1.5 仪器  23-24
  3.2 实验方法  24-33
    3.2.1 用于杂交瘤细胞性质鉴定及淘选用蛋白的制备  24-25
    3.2.2 杂交瘤细胞的制备  25
    3.2.3 单克隆抗体的型及亚类鉴定  25
    3.2.4 单克隆抗体亲和常数的测定  25-26
    3.2.5 杂交瘤细胞的制备及RNA提取  26-27
    3.2.6 cDNA的合成  27
    3.2.7 重、轻链可变区基因的PCR扩增  27-28
    3.2.8 scFv片段的组装  28-29
    3.2.9 pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建  29-30
    3.2.10 电转感受态菌TG1的制备  30
    3.2.11 scfv单链抗体噬菌体库的构建  30-31
    3.2.12 单链噬菌体抗体库的富集筛选  31-32
    3.2.13 scFv单链抗体融合表达和可溶性表达  32
    3.2.14 ELISA检测HrpA特异性的单链抗体  32-33
4 结果与分析  33-40
  4.1 淘洗用蛋白HrpA的制备  33
  4.2 HrpA单克隆抗体类型及亚类的鉴定  33
  4.3 HrpA单克隆抗体亲和力常数的测定  33-34
  4.4 VH和VL的获得  34-35
  4.5 Scfv DNA的组装和扩增  35
  4.6 噬菌体抗体库的构建及噬菌体展示  35-37
  4.7 Scfv特异性鉴定  37-38
    4.7.1 ELISA检测鉴定  37
    4.7.2 可溶性表达  37-38
  4.8 scFv的PCR验证  38-39
  4.9 测序  39-40
5 小结与讨论  40-43
  5.1 杂交瘤细胞的复苏培养  40
  5.2 杂交瘤细胞RNA的提取  40-41
  5.3 噬菌体抗体库的构建  41
  5.4 噬菌体表达载体  41
  5.5 抗体库的淘选  41-42
  5.6 测序  42
  5.7 应用前景  42-43
参考文献  43-48
附录  48-55
致谢  55

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害
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