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热应激对血管内皮细胞增殖的影响及CASK增殖信号通路的研究

作　者: 罗晓凤
导　师: 王仙园；罗向东
学　校: 第三军医大学
专　业: 烧伤护理学
关键词: 热应激血管内皮细胞分化抑制因子钙/钙调素依赖的丝氨酸激周期素依赖的蛋白激酶抑制剂
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

细胞的增殖状态决定着组织的修复速度，因此，研究应激状态对细胞增殖的影响对进一步了解创伤后组织修复的启动机理有着重要的意义。热应激是研究细胞应激反应最常使用的模型，主要优点是条件容易控制，稳定性好，可重复性好，因此在本中被采用。血管内皮细胞(VECs)目前已被视为创伤、休克、感染、心血管疾病、肿瘤和急性肺损伤等多种疾病中最易受损的细胞，是许多疾病发生发展的病理基础之一。创伤组织的修复需要内皮细胞增殖和分化的相互协调来发挥作用。目前对应激条件下内皮细胞增殖能力的改变以及通过何种途径调节这种改变还不清楚。分化抑制因子(Id)家族是参与细胞增殖与分化的关键蛋白,该蛋白的增殖调节作用已在多种细胞、组织得到证实。但在VECs的调控作用还未见报导,尤其对新近发现的Id1的上游分子－钙/钙调素依赖的丝氨酸激酶(CASK)在内皮细胞应激后的增殖调控及相关通路还不清楚。因此本实验以热应激为模型研究应激对VECs增殖的影响及Id1介导的相关信号转导机制,并初步研究Id1的上游分子CASK的增殖调节作用及涉及的调节通路。实验目的：1. 观察热应激对内皮细胞增殖能力的影响及其相关信号通路。2. 初步研究CASK信号对细胞增殖的影响。材料和方法：1) 细胞培养： ECV304细胞培养基为完全 M199添加10％小牛血清，37℃、5％CO2 孵箱培养，2-3天传代；2) 3H-TdR掺入法：43℃(或37℃对照)处理ECV304细胞2小时后,96孔板内每孔加入3H-TdR0.5uCi,按不同时相提取细胞,PBS洗涤3次,消化后用多道细胞收集仪将细胞收集在玻璃纤维纸上,晾干,加入闪烁液,分别测定液闪记数；3) 蛋<WP=9>白免疫印迹（Western Blotting）：接种ECV304细胞于Φ60mm培养皿中，43℃(或37℃对照)2小时处理后于不同时相点，或者CASK强制表达ECV304细胞经IPTG诱导后(或非诱导细胞作对照)，用M-PERTM蛋白提取液收集细胞总蛋白,BCA法定量后经SDS-PAG电泳,电转膜，加入相应抗体,免疫反应条带用增强化学发光法（ECL）显示；4) 强制表达细胞株的建立: 按阳离子脂质体LipofectAMINE介导的方法转染CASK插入质粒pOPRSVI-CASK和其调控质粒pCMVLacI。转染72小时后，加入含400ug/ml G418和400ug/ml潮霉素（Hygromycin）的M199选择培养液，连续筛选5周以上，至出现阳性克隆后将G418浓度降为100ug/ml、潮霉素降为50ug/ml持续筛选以保持阳性克隆的纯度。用25ug/ml丝裂霉素（mitomycinC）处理原代人胎成纤维细胞制成饲养单层，培养扩增阳性单克隆细胞。5) 免疫荧光细胞化学方法: ECV304细胞及诱导(IPTG4mM,10小时)后的ECV304-CASK细胞以5×104/皿细胞数培养于24孔培养板内, 加4%福尔马林浸透固定于玻片。用10%小牛血清封闭后加入CASK与ID1抗体,孵育过夜,加荧光素FITC和Texas red分别标记的相应二抗染色60分钟,37℃。1╳PBS洗两次后置激光共聚焦显微镜(LEICA,TCS-NT165 123)观察CASK与Id1的表达。6) 细胞增殖能力分析（细胞计数法）:将CASK稳定强制表达的ECV304细胞培养于24孔培养板(密度以20%左右为宜),以IPTG 4mM诱导10小时后(以非诱导细胞为对照),连续计数观察5天。以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制细胞生长曲线。结果：1) 热应激可使ECV304细胞ICAM-1蛋白表达增强，说明该热应激模型可激活内皮细胞。2) 受热43℃, 2小时，ECV304细胞的增殖受到抑制。3H-TdR掺入实验显示从热应激后12小时起实验组的3H-TdR掺入cpm值显著低于对照组，且一直持续至48小时(P<0.05)。两次独立重复实验均表明热应激可抑制血管内皮细胞的3H-TdR掺入量,因而具有增殖抑制作用。3) 应激后Id1蛋白表达逐步减弱与P16、P21的表达逐步增强呈相反趋势。正常ECV304细胞的Id1蛋白基础表达较高,在受热后呈缓慢的减弱, 热<WP=10>刺激后12小时减弱明显，至48小时基本消失。与此相反,P16、P21的表达呈逐渐增强的趋势,二者达到高峰的时相基本一致。这些结果提示热应激可激活ECV304细胞,引起Id1信号通路的变化,继而可能引起增殖相关的基因对血管内皮细胞的生长抑制。4) 成功构建了CASK强制表达的血管内皮细胞株(CASK-ECV304) 。通过蛋白免疫印迹方法测定转染纯化的单克隆细胞的CASK表达,证明这些转染细胞在IPTG 4mM诱导10小时可获得CASK的强阳性表达,其表达强度与非诱导的对照细胞相比有显著差异(p<0.01)。5) 免疫荧光细胞化学分析，观察CASK与Id1的细胞内定位，发现二者在正常ECV304细胞均定位于胞浆；CASK强制表达的ECV304细胞中见CASK的表达在胞浆处明显增强。提示CASK与Id1在血管内皮细胞中可能存在相互作用,CASK可能通过Id1参与了内皮细胞的增殖调控。6) 细胞计数结果显示强制表达CASK的ECV304细胞株的增殖受抑制。CASK强制高表达的ECV304细胞的增殖滞后于CASK正常表达细胞,这种增殖抑制现象出现早,在IPTG诱导后第2天即有明显差异(p<0.01),且一直持续至第5天。绘制细胞生长曲线发现,CASK-ECV304细胞的增殖曲线较对照组平缓,增殖能力明显低于对照组。观察到第5天差距仍然明显。结论：热应激43℃,2小时可激活血管内皮细胞株ECV304的ICAM-1表达,使血管内皮细胞的生物学性状发生变化，通过Id1信号通路上调增殖负调控基因（P16、P

全文目录

英文缩写一览表  3-4
英文摘要  4-8
中文摘要  8-11
论文正文热应激对血管内皮细胞增殖的影响及CASK增殖信号通路的研究  11-34
  前言  11-13
  第一部分热应激对血管内皮细胞增殖的影响  13-22
    材料与方法  13-15
    结果  15-18
    讨论  18-22
  第二部分 CASK增殖信号通路的初步研究  22-33
    材料  22
    方法  22-24
    结果  24-29
    讨论  29-33
  结论  33-34
致谢  34-35
照片  35-41
参考文献  41-46
文献综述钙/钙调素依赖的丝氨酸激酶的研究进展  46-55
  参考文献  52-55
攻读硕士期间发表/参加会议的文章  55

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