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人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移抑制的初步研究

作　者: 夏虎
导　师: 文金序
学　校: 第一军医大学
专　业: 呼吸内科
关键词: 内皮抑素 血管内皮抑制剂 毕赤巴斯德酵母 肝素亲和层析 LA795小鼠肺腺癌 T739小鼠
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


血管内皮抑素(endostatin，ES)是由0’Reilly等于1997年从小鼠血管内皮瘤细胞株(EOMA)的培养基中纯化获得的分子量为20KD的一种蛋白质。经证实其为胶原18C末端的一个内源性片段，并能特异性抑制新生血管内皮细胞增殖，从而达到抑制新生血管生成的目的。进一步的动物实验证明内皮抑素(ES)具有显著抑制原发实体肿瘤的生长和转移的作用，是一种强效的血管内皮生长抑制剂，重复使用未发现其有耐药性及毒副作用产生。重组表达的人内皮抑素分子量约为18.5KD，等电点为9.3，与鼠源性的内皮抑素氨基酸序列有86％的完全一致。本文重点研究将人内皮抑素(hES)基因整合入真核表达系统毕赤巴斯德(pichia．pastoris．GS115)酵母基因组，使其表达重组人内皮抑素(rhES)，并观察其对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制作用。 一 人血管内皮抑素(hES)在毕赤巴斯德酵母GS115(pichia.pastoris.GS115)中的表达、纯化及其体外细胞生物学活性检测 酵母分泌型表达重组质粒pPIC9／hES由本实验室自行构建。分别用SaLⅠ，SacⅠ和BgLⅡ三种限制性内切酶使重组质粒pPIC9／hES线性化，并用氯化锂转化法将目的基因整合到宿主菌GS115的染色体中。鉴定转化子表型(His~+Mut~s和His~+Mut~+)，经甲醇诱导各转化子分泌表达重组人内皮抑素(rhES)，用SDS-PAGE及Western-blot鉴定，筛选出高效表达株。选择一株高表达株进行诱导表达，表达上清超滤浓缩及70％硫酸铵沉淀后经Hitrap.heparin.HP进行肝素亲和层析纯化目的蛋白。采用MTT比色法观察重组人内皮抑素(rhES)是否抑制bFGF刺激的人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖。 实验结果显示通过基因重组技术获得了可分泌表达重组人内皮抑素(rhES)的高效表达转化菌株；各转化子分泌分子量约为18.5KD，并具有人内皮抑素抗原活性的蛋白条带；进一步在体外证实了重组人内皮抑素(rhES)能明显抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞的增殖。 二 小鼠肺腺癌LA795动物模型的建立及观察重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长和转移的抑制 将LA795小鼠肺腺癌细胞接种于30只T739小鼠背部近右前肢处皮下(4×10~5cells／mouse)，随机分成两组：rhES治疗组和PBS对照组，各组15只接种小鼠。选择一株高效表达重组菌，经甲醇诱导进行大量表达，用Heparin.sepharose.CL-6B亲和层析纯化目的蛋白，将获得的蛋白用于rhES治疗组。小鼠在接种后第6天开始接受治疗(分别给予rhES20mg／kg／d，等量PBSO．3ml／kg／d，IB月瘤边缘3cm处皮下注射，共14天）。观察各组小鼠肿瘤生长情况，肝、脾、肺肿瘤转移情况及各组小鼠生存期，并对各组数据进行统计学处理。 成功制备LA795小鼠肺腺癌动物模型并随机分为两组。经大量诱导表达获得足量的重组人内皮抑素（rhES），并用于治疗。动物实验结果表明：rhES治疗组肿瘤生长缓慢，治疗前后肿瘤平均体积分别为m．509士5．120E－02Cd），（2．073士0．202C旷）；而PBS处理组肿瘤体积生长迅速，治疗前后肿瘤平均体积分另为（0．491士 8．174E一02cm’），（6．761土0．208cm‘）。治疗结束时两组小鼠肿瘤大小比较具有显著差异（p＜0．001）。病理切片观察发现rhES治疗组可见广泛散在组织坏死，肿瘤细胞凋亡、萎缩，肺、肝、脾未见明显肿瘤转移灶；而PBS对照组肿瘤细胞生长良好，肺部可见散在肿瘤转移灶，肝及脾脏亦未见肿瘤转移灶。两组小鼠生存期分别为门 士3天）、（28士2天），统计学分析两组比较具有显著性差异（P＜0．of）。 本文成功地利用毕赤酵母一ichia。Pastorls．GSlls）表达系统表达了重组人内皮抑素什hES人并证实其具有良好的生物学活性，有效地抑制了！人795小鼠肺腺癌的生长和转移，同时延长了小鼠的生存时间。

全文目录


缩略词表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
引言  10-12
第一部分 人内皮抑素在毕赤酵母中的表达，纯化及其体外生物学活性检测  12-25
  材料和方法  13-19
  结果  19-22
  讨论  22-24
  小结  24-25
第二部分 重组人内皮抑素的大量表达，纯化及其抑制小鼠肺腺癌LA795生长和转移的实验观察  25-39
  材料和方法  25-28
  结果  28-37
  讨论  37-38
  小结  38-39
参考文献  39-41
综述  41-49
附页  49-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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