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阳离子嫁接物胶团基因给药系统研究

作　者: 赵梦丹
导　师: 胡富强
学　校: 浙江大学
专　业: 药剂学
关键词: 基因传递系统非病毒基因载体壳聚糖壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团基因转染 pEGFP-C1 LipofectamineTM2000 荧光探针
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

随着人类基因组计划的完成,为基因治疗奠定了坚实的基础,基因治疗已成为世界最活跃的研究领域之一。当前,基因治疗的首要问题是如何选择合适的基因导入系统,因为目的基因为高度亲水性的大分子物质,带有负电性,其自身难以穿透细胞膜,进入细胞后也容易被核酸酶降解,生物半衰期短。构建安全有效的细胞内基因递送系统,解决基因高效靶向及实现表达调控是药剂工作者的任务之一。目前的基因导入系统研究,可分为病毒载体(viral vector)系统和非病毒载体(non-viral vector)系统两类。病毒载体充分利用病毒高度进化所具有的感染和寄生特性而被广泛有效地应用,但病毒载体存在诸多不足,如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、制备较复杂及费用较高等。以阳离子脂质体、阳离子聚合物为代表的非病毒载体,由于其安全性能高、易于大规模制备等优点,在基因治疗应用中备受瞩目。由两亲接枝共聚物分子在水性介质中自聚集形成的聚合物胶团(polymer micelles,PM),是继乳剂、脂质体、微粒和纳米粒后,近年来研究十分活跃的靶向控释胶粒给药系统。因其具有一些特有的药物载体性质,如小粒径、高载药量、药物的控制释放、生物相容性以及生物膜通透性等特性,被认为是一种潜在的新型靶向给药系统。聚合物胶团通过主动或被动的方式,实现药物的目标靶向。通过“渗透与保留作用”(permeability and retention effect,EPR)可被动靶向肿瘤部位;胶团表面可嫁接配体(如叶酸等),实现药物的主动靶向。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
前言  14-17
第一章壳寡糖-硬脂酸嫁接物的制备及其理化性质研究  17-29
  1 试剂与仪器  17-18
  2 实验方法  18-20
    2.1 低分子量壳聚糖的制备及分子量测定  18
    2.2 壳寡糖-硬脂酸嫁接物的制备及结构确证  18-19
    2.3 嫁接物氨基取代度测定  19
    2.4 嫁接物临界胶团浓度测定  19
    2.5 嫁接物胶团的粒径与表面电位测定  19
    2.6 嫁接物胶团原子力显微镜测定  19-20
  3 结果与讨论  20-28
    3.1 嫁接物的合成及化学结构  20-23
    3.2 嫁接物氨基取代度  23-24
    3.3 嫁接物临界胶团浓度  24-25
    3.4 嫁接物胶团的粒径与表面电位  25-26
    3.5 嫁接物胶团空间结构  26-28
  4 小结  28-29
第二章嫁接物胶团/DNA纳米粒的制备及其理化性质研究  29-36
  1 试剂与仪器  29
  2 实验方法  29-31
    2.1 质粒DNA的扩增与提取  29-30
    2.2 嫁接物胶团/DNA纳米粒制备  30
    2.3 嫁接物胶团/DNA纳米粒原子力显微镜观察  30
    2.4 嫁接物胶团/DNA纳米粒的粒径与表面电位测定  30
    2.5 嫁接物胶团/DNA纳米粒凝胶阻滞分析  30-31
    2.6 嫁接物胶团/DNA纳米粒生物稳定性考察  31
  3 结果与讨论  31-35
    3.1 DNA纯度检测及含量计算  31
    3.2 嫁接物胶团/DNA纳米粒的粒径及表面电位  31-32
    3.3 嫁接物胶团/DNA纳米粒形态  32-33
    3.4 嫁接物胶团密接DNA能力考察  33-34
    3.5 嫁接物胶团/DNA纳米粒对核酶的稳定性  34-35
  4 小结  35-36
第三章壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团介导基因转染研究  36-47
  1 试剂与仪器  36-37
  2 实验方法  37-38
    2.1 嫁接物胶团/DNA纳米粒制备  37
    2.2 A549细胞培养  37
    2.3 嫁接物胶团/DNA纳米粒细胞转染及荧光显微镜观察  37-38
    2.4 嫁接物胶团基因转染定量研究  38
    2.5 细胞毒性实验  38
  3 结果与讨论  38-46
    3.1 血清对不同基因载体转染效率的影响  38-39
    3.2 倒置荧光显微镜观察细胞转染  39-41
    3.3 培养液pH值对转染效率的影响  41-43
    3.4 转染时间对转染效率的影响  43-44
    3.5 流式细胞仪定量测定细胞转染效率  44-45
    3.6 细胞毒性  45-46
  4 小结  46-47
第四章壳寡糖-硬脂酸嫁接物胶团介导基因转染机理研究  47-56
  1 试剂与仪器  47
  2 实验方法  47-49
    2.1 双荧光标记嫁接物胶团/DNA纳米粒制备  47-48
    2.2 A549细胞培养  48
    2.3 基因转染过程观察  48-49
  3 结果与讨论  49-54
    3.1 双荧光标记嫁接物胶团/DNA纳米粒理化性质  49-50
    3.2 双荧光标记嫁接物胶团/DNA纳米粒转染过程  50-54
  4 小结  54-56
结论  56-57
参考文献  57-63
综述  63-90
致谢  90

阳离子嫁接物胶团基因给药系统研究

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